同科生物|無(wú)縫克隆試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題與處理

　　一、平板上無(wú)克隆或克隆數(shù)目很少

　　1、可能的原因：引物序列不正確

　　解決方案：確認(rèn)引物序列含有15 bp與載體插入?yún)^(qū)域完全一致的同源序列。

　　2、可能的原因：PCR產(chǎn)物不純

　　解決方案：優(yōu)化PCR擴(kuò)增反應(yīng)以得到單一PCR產(chǎn)物；換一種純化方法，純化您的PCR產(chǎn)物。

　　3、可能的原因：反應(yīng)體系中DNA濃度太低

　　解決方案：在重組反應(yīng)中，加入推薦的DNA量。

　　4、可能的原因：不純的載體或插入片段抑制重組反應(yīng)

　　解決方案：推薦采用膠回收或離心柱法純化DNA后進(jìn)行重組反應(yīng)。

　　5、可能的原因：轉(zhuǎn)化過(guò)程中加入重組反應(yīng)液過(guò)多

　　解決方案：重組反應(yīng)液的轉(zhuǎn)化體積不應(yīng)超過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞體積的1/10。

　　6、可能的原因：感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低

　　解決方案：更換新鮮、高效的感受態(tài)細(xì)胞。

　　7、可能的原因：培養(yǎng)基中加入錯(cuò)誤或過(guò)多抗生素

　　解決方案：在轉(zhuǎn)化平板中加入正確、適量的抗生素。

　　二、假陽(yáng)性克隆數(shù)目多

　　1、可能的原因：克隆載體線性化不完全

　　解決方案：重新酶切您的載體，增加酶切時(shí)間，并膠回收純化。

　　2、可能的原因：PCR使用的模板質(zhì)粒抗性與所需克隆載體抗性相同造成的污染

　　解決方案：可在PCR反應(yīng)之前先將模板質(zhì)粒線性化；PCR產(chǎn)物用DpnI處理，消化模板質(zhì)粒，然后再純化。

　　3、可能的原因：轉(zhuǎn)化用平板放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致抗性失效

　　解決方案：確認(rèn)平板新鮮配置，并含有正確、適量的抗生素。

　　三、克隆含有不正確的插入片段

　　可能的原因：PCR產(chǎn)物混有非特異性片段

　　解決方案：優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系，提高特異性或膠回收純化目的片段。

　　產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：本公司提供分子克隆領(lǐng)域所需全線產(chǎn)品，包含基因重組/克隆、電泳檢測(cè)、核酸提取/純化、PCR/qPCR/RT-PCR以及細(xì)胞因子等系列產(chǎn)品，各類(lèi)產(chǎn)品均得到客戶高度認(rèn)可，且反饋良好。